赖氨酸乙酰乙酰化（Kacac）是由代谢物乙酰乙酸驱动的一种分子机制，酮体通过该机制在能量供应之外调控细胞功能。然而，由于检测和功能验证方面的技术限制，对Kacac的全面表征一直存在困难。
2026年2月20日, 中国科学院上海药物研究所黄河独立通讯在Science Advances 在线发表题为“Covalent capture and genetic code expansion enables chemoproteomic profiling and functional characterization of lysine acetoacetylation”的研究论文。该研究报道了一个用于系统性研究Kacac的整合平台。利用其独特的反应性酮羰基基团，作者开发了Aca-Bio探针，这是一种基于羟胺的探针，可通过酮靶向的共价标记和pH控制的可逆富集，实现对Kacac肽段的特异性富集。
将该方法应用于小鼠肝脏，作者在125个蛋白质中鉴定出260个Kacac位点，揭示了其在代谢通路中的显著富集。同时，作者建立了一种能够实现位点特异性Kacac嵌入的遗传密码扩展系统。利用该方法，作者证明HMGCS2蛋白的K310acac通过削弱底物结合而显著降低其催化活性。这种双平台策略为Kacac的全局性谱图分析和位点特异性功能表征建立了一个全面框架，从而有助于系统性地探索其生理作用与病理学意义。
由代谢物驱动的翻译后修饰（PTM）通过介导动态蛋白质调控以反映细胞代谢状态，在生理和病理过程中发挥着关键作用。酮体，包括丙酮、乙酰乙酸和β-羟基丁酸，是通过脂肪酸β-氧化产生的肝脏代谢物，其生物合成在葡萄糖受限条件下（如禁食、长时间运动和胰岛素缺乏性疾病）显著上调。除了作为替代能量来源的经典作用外，新出现的证据表明，代谢物可作为多种PTM的前体，从而发挥信号分子的功能。包括乳酸、琥珀酸和β-羟基丁酸在内的几种短链代谢物已被证明可驱动赖氨酸酰化，从而直接调控蛋白质功能和细胞信号网络。作者先前的研究发现乙酰乙酸是赖氨酸乙酰乙酰化（Kacac）的生物合成前体。Kacac是一种结构独特的PTM，其特征是含有一个反应性酮基。这一发现拓展了作者对酮体调控机制的理解，超越了其作为能量底物的经典作用。然而，要全面阐明Kacac的生理和病理重要性，必须解决两个基本挑战：第一，实现高效、深度且位点分辨的Kacac修饰鉴定；第二，确定特定Kacac位点对底物蛋白的功能影响。目前，重大的技术局限阻碍了这两个领域的进展。传统的赖氨酸酰化鉴定方法主要依赖于基于抗体的亲和富集。虽然作者先前使用抗原模拟物开发了Kacac抗体，并在蛋白质印迹应用中显示出有效性，但这些抗体在Kacac肽段富集方面表现欠佳，因此需要开发用于特异性Kacac富集和鉴定的替代方法。此外，传统的突变分析仅能提供间接的功能推断，可能无法准确反映该修饰的真实生物学效应。模式流程图（图片源自Science Advances ）与其他已知的PTM不同，Kacac具有一个独特的活性酮羰基，能够参与特定的化学反应，而不受经典氨基酸的干扰。在本研究中，作者利用这一结构特征，设计了Aca-Bio探针。该探针包含一个能与酮基形成共价肟的羟胺基团、一个确保空间可及性的聚乙二醇（PEG）连接臂，以及一个便于链霉亲和素介导富集的生物素标签。该探针通过酮基特异性化学靶向和可逆亲和纯化，实现了Kacac修饰肽段的特异性富集，从而能够在可控解离后进行后续的质谱鉴定。利用该方法，作者在禁食C57BL/6小鼠的肝组织中鉴定出125个蛋白上的260个Kacac位点，极大地扩展了Kacac底物谱，并揭示了其在代谢相关通路中的显著富集。同时，作者建立了一个能够实现位点特异性Kacac掺入的遗传密码扩展（GCE）系统。利用该系统，作者表征了酮体代谢关键调控酶——羟甲基戊二酰辅酶A（CoA）合酶（HMGCS2）中K310acac的功能影响。动力学分析表明，与野生型（WT）蛋白相比，K310acac变体的催化活性显著减弱，这表明Kacac通过削弱底物结合能力，显著抑制了酶的功能。这一整合了化学蛋白质组学探针与GCE的技术平台，建立了一个全面的框架，既能进行全局Kacac底物谱分析，也能进行位点特异性Kacac功能表征。这些方法学进展规避了抗体依赖性方法的一些局限，为Kacac介导的调控提供了直接的机制性见解，从而有助于深入探索Kacac在多种细胞过程中的作用。国科大杭州高等研究院药学院助理研究员宋晓翰为本文第一作者，上海药物所黄河课题组研究生芦宇涵、郭欣龙参与本研究，上海药物所黄河研究员为本文通讯作者。该研究得到了中国科学院战略性先导科技专项、国科大杭州高等研究院专项资金及国家自然科学基金等项目的资助。
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aeb5106
2026-02-25
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