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尿苷二磷酸 (UDP) 糖基转移酶催化的类黄酮 O-糖基化对其治疗效果至关重要。然而，大多数 UDP-糖基转移酶面临三大限制：活性低、区域选择性差和底物可用性受限，阻碍了它们的药物应用。
2025 年 10 月 3 日，浙江大学陈伟独立通讯在Science Advances 在线发表题为“Comprehensive engineering of novel glycosyltransferase for efficient, donor-promiscuous, and regioselective glycosylation of flavonoids”的研究论文。该研究对一种先前未鉴定的糖基转移酶 UGT75AJ2 进行了蛋白质工程改造，该酶具有 3′,7-O-糖基化能力。
本研究提出的方法包括三种策略：(i) 开发一种有针对性的、合理的、迭代的定点诱变策略，辅以虚拟筛选和迭代诱变，设计出突变体 Mut4-1 (S367A/V274A/F82V/I132T)，其相对催化活性提高了 128 倍； (ii) 通过基于结构的工程改造，增强了该酶与更广谱糖供体的相容性，获得了突变体 S14G/F366H/S367G，并展示了对多种糖供体的有效利用；(iii) 构建了靶向突变体库，通过活性位点分析增强了区域选择性，从而获得了对目标糖基化位点具有高选择性的突变体。这项全面的研究解决了 UDP-糖基转移酶蛋白质工程中的主要挑战，为促进黄酮类糖苷的开发提供了创新方法和见解。
黄酮类化合物是植物次生代谢产物中种类繁多的一类，主要包括黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷醇和花青素等亚类。这些化合物对人类健康至关重要，具有显著的膳食和药用价值。大量研究强调了其抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、代谢稳定和抗癌等多种健康益处。糖基化是植物次生代谢中一种重要的后修饰，它不仅能改变糖苷配基的催化效率、溶解度和稳定性，还能增强这些化合物的药理活性和生物利用度。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 (C3G)、槲皮素-3-O-糖苷和木犀草素-7-O-糖苷等糖苷类化合物因其在对抗氧化应激、炎症和癌症方面的作用而闻名，凸显了这些天然药物的重要性。迄今为止，共有 36 种基于类黄酮的候选药物处于不同阶段的临床试验。其中，大豆黄酮、橙皮苷和黄芩素等 19 种类黄酮已获批准上市，类黄酮糖苷占 36.8%。传统的化学糖苷化通常需要繁琐的保护和脱保护步骤，并且特异性和产率较低，而生物催化糖苷化以环境友好的方式提供了一种可行的替代方案。尿苷二磷酸 (UDP) 依赖性糖基转移酶 (UGT) (EC 2.4.x.y) 属于糖基转移酶家族 1，其以 UDP 糖为供体，将糖转移至亲核受体，在天然糖苷（例如黄酮苷）的生物合成中至关重要。鉴于植物 UGT 在这些生物合成途径中的重要作用，其在增强植物源天然产物糖基化方面的潜力已引起广泛关注。迄今为止，从拟南芥、茶树、甘草等植物中鉴定出的O-糖基转移酶主要负责C-3、C-5和C-7位羟基的糖基化修饰。然而，大多数野生型O-糖基转移酶存在酶活力低、底物范围窄和糖基供体相容性差等缺点，严重阻碍了其在药物开发中的应用。为了应对这些挑战，结构引导的蛋白质进化策略，例如组合活性位点饱和测试（CAST）、迭代饱和诱变（ISM）和聚焦理性迭代位点特异性诱变（FRISM），已被广泛研究。这些方法旨在改变UGT活性位点内的关键残基，从而定制其催化功能以满足特定需求。例如，对印度醉茄（Withania somnifera）中的酶WsUGT73A16进行定向进化，改变其底物结合口袋构象，得到突变体A337C和Q339A，与野生型相比，其催化效率分别提高了2.61倍和6.78倍。此外，通过CAST/ISM，对印度芒果（Mangifera indica）中的酶MiCGT获得了VFAH四重突变体（W93V/V124F/F191A/R282H），其3-O-糖基化选择性增强，对槲皮素的催化活性提高了120倍。利用ISM技术，罗汉果（Siraitia grosvenorii）UGT74AC1突变体M7（T79Y/L48M/R28H/L109I/S15A/M76L/H47R）提高了催化效率，并延长了底物混杂性。同样，来自同一物种的三个UGT74AC2双突变体在定向进化后也表现出更高的转化率和对3-OH、7-OH和3,7-OH的区域选择性。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ScUGT51通过定点诱变和ISM技术进行工程改造，突变体M5-1+E96K/K92A的催化效率（kcat/Km）比野生型提高了1800倍。即使目前取得了进展，O-糖基转移酶蛋白质工程研究的匮乏和不足，仍然对相关糖苷化合物的生物合成构成了巨大的技术障碍，而这些糖苷化合物在农业、食品和医药领域有着巨大的应用潜力。上述综合蛋白质工程策略通常需要复杂的高通量突变筛选步骤，这带来了巨大的挑战，例如实验时间长、劳动强度大以及发现有益突变的概率低。因此，开发一种快速、可靠且广泛适用的O-糖基转移酶定向进化策略至关重要。图1. UGT75AJ2的功能特性（图源自Science Advances）本研究利用基因挖掘技术，发现了一个此前未知的植物糖基转移酶UGT75AJ2，该酶能够催化黄酮类化合物在3′-OH和7-OH位点的糖基化（详细的基因挖掘方法见补充材料）。UGT75AJ2独特的酶活性使其成为天然蓝色色素和高价值黄酮苷生物合成的有希望的候选基因。然而，野生型UGT75AJ2在酶活性、糖供体混杂性和区域选择性方面表现出较弱的催化能力。为此，作者设计了一种定制的FRISM进化策略，以C3G (1)为基准底物。该方法基于对UGT75AJ2的平均突变能量、底物结合口袋构象、序列保守性和活性位点特性的分析。最后，在UGT75AJ2突变体中，催化效率显著提高，底物和供体选择性更广，区域选择性更严格。本研究为改进酶工程程序和减少对大量突变体库筛选的依赖奠定了方法学基础。该方法为酶的定制提供了一个灵活且适应性强的框架，从而实现了黄酮苷的精准合成，有望在生物制药、功能性食品和植物育种等多个领域获得广阔的应用前景。https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adu5064#tab-contributors
2025-10-15
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