黄金搭档！两年合作三篇Nature Chemistry！

全文概要

如何实现传统化学难以企及的自由基反应立体控制？如何构建具有挑战性的2,5-反式脯氨酸骨架？加州大学圣塔芭芭拉分校杨扬与匹兹堡大学刘鹏团队在《Nature Chemistry》上报道了一项突破性研究。他们巧妙重构吡哆醛磷酸（PLP）酶的催化功能，将其转化为全新的“自由基碳连接酶”，并与亚胺还原酶（IRED）级联，开创了一条光驱动的生物合成新路径（图1）。该策略不仅实现了在化学和生物学上均属未知的自由基C–C偶联反应，更能以近乎完美的立体选择性，一键式合成拥有2-3个手性中心、特别是elusive 2,5-反式构型的多取代非天然脯氨酸。这项工作打破了自由基化学与复杂手性分子合成之间的壁垒，为药物化学与合成生物学提供了强大的新工具。

值得注意的是，杨扬教授&刘鹏教授，近两年已发表了一篇Science，一篇Nature，两篇Nature Chemistry。

图1. 合成路径示意图

一、研究背景

非经典氨基酸在药物设计、蛋白质工程和生物材料等领域具有重要价值。其中，具有多个手性中心的环状非经典氨基酸（如多取代脯氨酸）的立体选择性合成一直是有机合成和生物催化领域的难点。传统的合成方法往往面临步骤繁琐、立体控制不足或底物适用范围窄等问题。尤其是具有2,5-反式构型的脯氨酸衍生物，其合成更具挑战性。

光生物催化作为一种新兴策略，通过结合光氧化还原催化和酶催化的优势，为自由基反应的立体控制提供了可能。然而，开发一种在化学和生物学上均属全新的自由基反应模式，并实现其高效、高选择性的催化，仍是该领域面临的重大挑战。

二、研究思路

本研究的核心思路是设计一个双酶级联的光生物催化系统，将自由基碳-碳键形成与后续的立体选择性还原步骤相结合。

1. 催化体系的设计与构建

作者将目光投向了一类天然催化天冬氨酸β-脱羧并随后进行醛醇缩合反应的吡哆醛磷酸依赖性酶。他们设想，若能将该酶改造为“自由基碳连接酶”，使其能够捕获光催化产生的自由基中间体，并与酶活性中心内形成的持久性烯胺中间体发生偶联，便可实现全新的自由基C–C键形成反应（图2）。

具体而言，该设计包含两个关键步骤：

（i）光生物催化自由基C–C偶联：天冬氨酸与PLP酶形成烯胺中间体，该中间体与光氧化还原催化产生的α-羰基自由基发生立体选择性偶联，生成环状亚胺产物。

（ii）立体选择性亚胺还原：利用从宏基因组库中筛选得到的高立体选择性亚胺还原酶，对前述步骤产生的环状亚胺进行还原，精准构建非天然脯氨酸的手性中心，甚至通过动态动力学不对称转化过程实现多手性中心的控制。

图2. 自由基生物催化模式的设计

2. 反应发现与条件优化

光生物催化C–C偶联的建立与优化

研究以L-天冬氨酸和α-氯苯乙酮为模型底物，评估了多种PLP依赖性天冬氨酸β-脱羧酶（图3）。他们发现，来自ustiloxin B生物合成途径的工程化酶UstD2.0在钌光催化剂存在下，能够以44%的产率和>99:1的对映体比率催化目标环状亚胺的生成。对照实验证实了该反应的光生物催化本质：缺少光催化剂或PLP酶均无产物生成。

通过对UstD2.0进行半理性工程改造，作者获得了活性显著提升的变体UstD2.0 L392G（命名为AfPLPβ），将产率提高至73%，同时保持优异的对映选择性。该酶还能区分天冬氨酸的对映体，优先转化L-构型，展现了其在动力学拆分中的应用潜力。

亚胺还原步骤的立体控制

获得环状亚胺后，作者探索了将其还原为非天然脯氨酸的方法。化学还原剂（如NaBH₄）虽能有效还原，但非对映选择性较差，且主要生成2,5-顺式产物。为实现难以获得的2,5-反式构型，作者对宏基因组来源的亚胺还原酶进行了高通量筛选，成功鉴定出cpIRED这一高效生物催化剂，能以>99:1的非对映选择性和>99%的产率专一性地生成2,5-反式脯氨酸产物。

图3. 反应发现与条件优化

3. 底物适用性与合成应用展示

广泛的底物范围

在最优条件下，作者系统考察了该级联反应的底物适用范围（图4）。结果表明，AfPLPβ和cpIRED均表现出优异的底物普适性。芳环上带有给电子基（如甲基、甲氧基、甲硫基）或吸电子基（如氟、氯、溴、氰基、酯基、三氟甲氧基）的α-卤代酮类底物都能顺利参与反应，以高立体选择性得到相应的5-芳基取代脯氨酸。此外，该体系还能兼容含吡啶环的杂芳基底物，并能成功合成具有合成价值的4,4-二氟代脯氨酸和5-烷基取代脯氨酸。

多取代脯氨酸的立体选择性合成与动态动力学不对称转化

为进一步挑战合成难度，作者尝试合成具有三个连续手性中心的4,5-二取代脯氨酸（图5）。他们发现，由α-支链卤代酮生成的环状亚胺在反应条件下其α-位手性中心会发生差向异构化。作者巧妙地将这一“缺陷”转化为优势，利用筛选出的cpIRED催化动态动力学不对称转化过程，成功地从外消旋的亚胺底物出发，以高收率和高立体选择性（非对映体比率>19:1，对映体比率>99:1）合成了系列结构复杂的多取代脯氨酸，包括由环状α-卤代酮衍生的三环类非经典氨基酸。

克级规模合成与产物衍生化

为展示该方法的合成实用性，作者成功进行了克级规模（132 mg）的光生物催化反应，高效制备了关键中间体环状亚胺（图6）。随后，通过化学还原或酶催化还原，可分别选择性地得到2,5-顺式脯氨酸、2,5-反式脯氨酸，甚至通过Pd/C催化氢解脱羧得到开链的非经典氨基酸，实现了产物的多样化衍生。

图4. 底物范围

图5. 合成应用展示

图6. 克级规模合成与产物衍生化

4. 机理研究与理论计算

为深入理解反应机理，作者进行了自由基捕获实验和密度泛函理论计算（图7）。自由基捕获实验证实了α-羰基自由基中间体的存在。理论计算基于酶晶体结构构建了团簇模型，揭示了PLP结合的烯胺中间体具有高度的亲核性，可与光催化产生的亲电性自由基发生区域选择性加成。计算还阐明了活性中心内保守赖氨酸残基在后续的质子转移步骤中的关键作用，解释了反应为何能实现高度的对映体控制。

图7. 机理研究与理论计算

三、小结

本研究通过理性设计和改造PLP酶，发展了一种新型的光驱动吡哆醛自由基生物催化模式，实现了化学和酶学中均未见报道的分子间自由基C–C偶联反应。该策略与高立体选择性的亚胺还原酶催化相结合，成功构建了具有挑战性2,5-反式构型及多手性中心的非天然脯氨酸库。这项工作不仅拓展了自由基生物催化的边界，也为复杂手性分子的绿色、高效合成提供了新思路。

原文详情

Chen Zhang, Jun Zhou, Binh Khanh Mai, Zijun Qin, James Finnigan, Samantha Gittings, Peng Liu, Yang Yang. A pyridoxal radical carboligase and imine reductase photobiocatalytic cascade for stereoselective synthesis of unnatural prolines. Nat. Chem. (2025).

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