冷冻电镜助力！细菌“天然免疫”细节揭晓

2020-06-02

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当病毒入侵哺乳动物细胞时，最初识别病原DNA收到这一“情报”的蛋白发出信号，向下一个蛋白传递，环环相扣，激活天然免疫反应。哺乳动物细胞正是利用这样的多条天然免疫通路，介导免疫应答。

那么，细菌等原核细胞又是如何对外源DNA进行“天然免疫识别和应答”呢？

宿主细胞对病原DNA的免疫识别和应答（高璞供图）

北京时间2020年6月1日晚23点，《自然-微生物学》（Nature Microbiology）在线发表了中国科学院生物物理所高璞、章新政团队的最新研究成果。这项研究着眼一种细菌识别外源入侵DNA的免疫防御系统，即I型限制修饰（Type I R-M）系统。

研究人员利用冷冻电镜技术系统性解析了Type I R-M系统与靶标DNA及两种噬菌体抑制蛋白（Ocr和ArdA）的多种生理构象的三维结构，并配合突变及生化分析，揭示了该系统的组装、催化和调控机制。

6个步骤展开细节

Type I R-M系统广泛存在于原核生物中，可以对宿主自身DNA进行甲基化修饰，并对未经修饰的噬菌体DNA进行识别和切割，从而为宿主细胞提供强大的天然免疫保护。

高璞向《中国科学报》介绍，自1968年，这一系统被鉴定以来，许多研究人员利用微生物学、生物化学及分子生物学等手段对其开展了广泛研究。

“例如，我们已经知道：该系统包括的亚基（蛋白）种类、不同Type I R-M系统特异识别的靶标DNA序列、Type I R-M系统存在的组装方式、以及噬菌体编码蛋白可抑制该系统的活性等等。”

但是，在分子甚至原子水平上，仍然有很多问题未得到解答，包括：不同亚基之间如何相互作用并组装成有特定功能的复合物？Type I R-M系统是否以及如何通过构象变化来精确调控不同的酶活性？Type I R-M动态构象变化的结构基础是什么？噬菌体蛋白抑制Type I R-M系统酶活性的分子机制是什么？

为了回答这些问题，则必须了解Type I R-M系统在不同构象状态及组装方式下的结构信息。

多年来，高璞一直致力于揭示Type I R-M系统的组装、催化和调控机制。2011年，他在攻读博士期间，就解析了该系统DNA识别亚基的晶体结构。2017年，他与中科院生物物理所梁栋材院士课题组合作，解析了该系统甲基化酶复合物在不结合靶标DNA状态下的晶体结构。而此次的最新成果，则是他们团队与章新政课题组合作，解析了该系统多个生理状态下的冷冻电镜结构。

基于本项最新研究，研究人员将Type I R-M全酶的工作模型表述为以下6个步骤：

1、未结合靶DNA时，全酶复合物处于一种动态开放的Resting State；

2、结合靶DNA后，全酶复合物转变为紧凑的Translocation State，并将DNA定位于两个R亚基的Motor-1和Motor-2结构域之间；

3、通过水解ATP，两个R亚基开始催化DNA translocation，并将DNA从两端拉向Type I R-M复合物，进而形成特殊的DNA loop结构；

4、当DNA translocation受阻时，Type I R-M全酶转变为Intermediate State，此时仅有一个R亚基具有DNA translocase活性；

5、通过两个R亚基的协同作用，全酶复合物进入Restriction State，两个R亚基的Nuclease结构域和两个M亚基的Catalytic结构域均靠近DNA，发挥DNA切割和甲基化修饰功能；

6、切割和修饰结束后，全酶复合物与DNA相互分离并返回到初始的Resting State。

Type I R-M全酶复合物的工作模型图（高璞供图）

冷冻电镜助力“凝固”瞬间

为了更清楚的理解上述状态转变过程，研究人员在冷冻电镜的帮助下“凝固”了其中的多个瞬间。

“首先实验的第一步是要获得高质量的复合物样品，我们采取细胞内共表达以及体外重组相结合的方式，以经典的Type I R-M系统EcoR124I为研究对象，制备了核心复合物M2S1以及全酶复合物R2M2S1。然后，进一步获得了它们与靶标DNA及两种噬菌体抑制蛋白（Ocr和ArdA）的复合物样品。”高璞表示。

接下来，研究人员利用冷冻电镜单颗粒重构方法，摸索了上述多种复合物样品的制样及数据收集条件，并解析了不同分辨率的共10种状态的三维结构。