万能生物催化剂全长晶体结构获破解
2020-06-01
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完整酶结构 郭瑞庭供图
电子传递机制 郭瑞庭供图
《自然—通讯》在线发表了首个细胞色素P450酶的全长精细三维结构，解答了这一数十年未解的科学难题。
湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室教授陈纯琪、马立新和郭瑞庭合作完成了这项工作。他们解析了一种P450酶CYP116B46的晶体结构，并阐明电子在分子内传递的方式。这对了解P450的结构及完整机理提供了重要指导，且对P450酶在医药和工业领域的应用具有重要价值。
万能生物催化剂
细胞色素P450是一种酶蛋白，最早于1955年在老鼠的肝脏细胞中发现，因为其与一氧化碳结合的还原态吸收光谱波长约在450 nm而得名。
该蛋白由血红素（heme）结构域和含有黄素单核苷酸（FMN）的还原酶结构域组成；这两个部分通过包含铁硫簇的铁氧还蛋白域相连。“细胞色素P450是一个庞大的酶家族，简称为CYP，参与许多天然产物的合成途径与毒物、药物代谢反应。”论文通讯作者陈纯琪告诉《中国科学报》，在植物中，P450家族参与一些特殊化合物的合成，如青蒿素和紫杉醇；在人体中，P450家族主要参与解毒过程，如化解可以导致癌症的黄曲霉毒素等。
这是因为P450的催化多能性很高，涉及20余类反应，包括羟化反应、环氧化反应和成环反应等。其底物谱极广，可以识别芳香族、聚酮类、萜类、肽类、糖类等类型的底物，拥有“万能生物催化剂”之称。
它还具有高度区域选择性和立体选择性，能特异性的识别结构位点和方向。此外，P450酶的底物结合区具有高度可塑性，透过酶工程改造可以改变底物谱，在重要化学品和药物制造方面的应用深具潜力。
因此，药物活性化与代谢主要都是由CYP这个酶家族所负责的，大约囊括了生物体中此类代谢的75%。
P450系统广泛存在于所有生物甚至病毒中，已发现超过18000种P450系统。人体内已经发现超过57种P450系统，大部分是膜蛋白，主要分布在粒线体内膜或内质网上。不过，在大肠杆菌中未发现此类酶蛋白的踪影。
“绝大多数P450酶需要氧化还原酶来提供电子，以活化底物结合区的血红素，进而转化底物。”陈纯琪说，建立一个P450系统必须寻找同源或者相匹配的氧化还原酶。
在P450系统的9个家族中，只有2个家族在同一条多肽链上自带氧化还原酶，被称为自给自足的P450酶，这类酶主要来自细菌。另外一些P450系统则需要从外界获得匹配的氧化还原酶，这种情况主要发生在动物体内。
“自给自足的P450酶在生物技术应用方面是极具吸引力的生物催化剂。因此，自给自足P450酶内部电子如何传递是一个非常有趣且重要的课题。”论文通讯作者郭瑞庭告诉《中国科学报》，此前，科学家已经对P450系统中的血红素和FMN等结构域研究比较清楚，但对中间连接部分始终不了解，缺乏全长精细结构。
“在蛋白纯化及培养晶体的过程中，P450酶极易从中间断裂或降解，因而很难获得完整的全长三维立体结构。”陈纯琪说。
获得全长P450精细三维结构
目前已知的自给自足P450酶有两类。第一类以来源于巨大芽孢杆菌的CYP102A1为代表，由氮端的血红素结构域和碳端的P450还原酶 （CPR）组成，电子传递的方向是从碳端向氮端传递。虽然这类P450酶的全长精细结构仍然缺失，但对于这类P450酶的电子传递机理也有了一些粗略的理论。
第一类自给自足P450酶结构域排列 郭瑞庭供图
第二类是CYP116，该研究所涉及的CYP116B46就属于这一类。这类P450由氮端的 heme结构域和碳端的邻苯二甲酸二加氧酶还原酶类结构域（PDR）组成，PDR包含了FMN-依赖的还原酶结构域与铁氧还蛋白结构域。
第二类自给自足P450酶结构域排列 郭瑞庭供图
自给自足P450酶的一条多肽链内是如何将电子从碳端传递到氮端的血红素的？由于30多年来长期缺乏全长的蛋白质结构信息，在该项研究之前尚不清楚。
英国曼彻斯特大学化学生物学教授萨宾·L·弗利奇（Sabine L. Flitsch）说：“获得全长酶是一项了不起的成就。”许多小组，包括她自己的小组，都试图解析这些结构，因为它们作为生物催化剂具有重大的应用潜力。
“可以说晶体制备已经超越科学，几乎成为一门艺术。”陈纯琪说，要想获得一个完整的大蛋白晶体结构，其难度可想而知。
该研究所用的CYP116B46相对稳定，加上郭瑞庭长年从事晶体制备和结构解析工作积累的丰富经验，他们得以利用X射线晶体学对其完整的晶体结构进行解析。
结构分析表明，在这种酶中，FMN足够接近铁硫簇以实现直接电子转移；但血红素离铁硫簇太远，不允许电子直接转移，而是依靠5个“二传手”氨基酸实现传递。
“我们解析了来源于CYP116B46全长的晶体结构，且建立了清晰的酶结构模型。”郭瑞庭说，这条连续性的多肽折叠成三个结构域，由两段连接肽相连，从氮端到碳端依序为：血红素结合域、还原酶结构域和铁氧还蛋白结构域。
郭瑞庭介绍，结构解析后发现，CYP116B46三个结构域的排列与电子传递的方向竟然非常一致。血红素结合域的底物结合区朝向外，有利于底物进入结合，这显示结构的排列相当合理。其中，还原酶结构域和铁氧还蛋白结构域的直线距离为7.9Å，有利于电子的直接传递。
“科学家普遍认为，小于8 Å的距离是电子可以直接传递过去的。”郭瑞庭说。
另一方面，铁氧还蛋白结构域和血红素的直线距离达25.3 Å，超过目前认定的有效直接电子传递距离。
5个“二传手”传递电子
“在这两个氧化还原中心之间，由其他辅助因子来帮助电子传送的可能性较低。”郭瑞庭解释说，因为结构显示二者之间的通道狭窄，缺乏其他辅助因子结合的特征。另一方面，考虑到氨基酸也是一种电子载体，所以二者之间的氨基酸也有可能在电子传送的过程中扮演重要角色。
“现在我们有机会设计还原酶结构域和电子转移途径。”陈纯琪说。
为了分析这些氨基酸的侧链基团对于CYP116B46酶活性的影响，他们将这些位点分别突变成丙氨酸，并进行产物生成量的测定来评估每个氨基酸扮演的角色。
郭瑞庭介绍，酶活测试结果显示，R388、R718、E723、S726和E729的丙氨酸突变体活性明显下降。将这些位点再次标定在结构上，可以看出大致的电子传递方向。
R378A突变体蛋白质缺乏血红素造成的红色，一氧化碳处理后也没有出现吸收峰带移的现象。加上R378的所在位置邻近血红素，推测R378可能与结合血红素相关。因此，R378A的突变造成的效应更加复杂，需要进一步实验才能判断此一位点对于CYP116B46电子传递的影响。
[2Fe-2S] 与heme通道的氨基酸突变验证 郭瑞庭供图
“知道了氨基酸在电子传递过程中扮演的角色之后，我们就可以考虑寻找替换别的有效氨基酸，提高电子传递效率。”郭瑞庭解释说，这就好像换上一个手更长的“二传手”，让电子能更快的传递过去。
这种设计将提高催化反应的效率。P450全长结构的解析，对于了解自给自足P450酶催化机理是一个非常重要的里程碑，对于P450酶改造与应用更具有重要的指导意义。
相关论文信息：https://doi.otg/10.1038/s41467-020-16500-5
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